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丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成 不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子 的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一 般說來，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機(jī)械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物 質(zhì)，1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增 加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺，以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能。
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對(duì)熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。
④丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙 丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝 膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和 另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表：
聚合反應(yīng)催化劑配伍
引 發(fā) 劑
加 速 劑
（NH4)2S2O8
TEMED
(NH4)2S2O8
DMAPN
核 黃 素
TEMED
注：(NH4)2S2O8，過硫酸胺 TEMED：N，N，N，N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴 用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液， 稱光聚合反應(yīng)。 聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響： 1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應(yīng)終止，所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣 隔絕。 2、某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合反應(yīng)。 3、某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。 4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢。 以上幾點(diǎn)在制備凝膠時(shí)必須加以注意。 凝膠的篩孔，機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T%表達(dá)；凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示，可用下式計(jì)算：
公 式
a：丙烯酰胺克數(shù)； b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積（毫升） 凝膠濃度過高時(shí)，凝膠硬而脆，容易破碎；凝膠濃度太低時(shí)，凝膠稀軟，不易操作。
交聯(lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊狀。 聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對(duì)流減低擴(kuò)散的能力，而且因?yàn)樗哂腥?度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大 小和形狀，這是凝膠的分子篩作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純 的支持物，因此，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外，還必須注意與凝膠本 身有關(guān)的各種性質(zhì)（網(wǎng)孔的大小和形狀等）。可通過下式計(jì)算來選擇適當(dāng)?shù)哪z網(wǎng) 孔。
公 式
式中：P為網(wǎng)孔平均直徑，C為多聚體濃度，d為該多聚體分子直徑（若不是卷曲的分 子應(yīng)為），K為常數(shù)，K值取決于漲膠的幾何構(gòu)型，假如多聚體的鏈?zhǔn)且越朴谥苯?交聯(lián)的，則約為1.5根據(jù)此式，我們可以通過多聚體濃度C近似地計(jì)算出網(wǎng)孔直徑，例 如已知多聚體濃度為5%，其網(wǎng)孔平均直徑應(yīng)為：
公 式
這樣的計(jì)算是粗略的，與實(shí)際情況有一定距離，有人測(cè)定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網(wǎng)孔大小，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān)，總濃度愈大，孔徑相應(yīng)變小，機(jī)械 強(qiáng)度增強(qiáng)，與總濃度不變時(shí)，甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時(shí)孔徑zui小，高于或 低于此值時(shí)，聚合體孔徑都相對(duì)變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個(gè)重要的參數(shù)，它 往往決定了電泳的分離效果。經(jīng)過不斷的實(shí)踐，得到了如表3所示的經(jīng)驗(yàn)值，在一般情況下，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃 度的凝膠，所得電泳結(jié)果往往是滿意的，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標(biāo)準(zhǔn)凝 膠”。
對(duì)那些用于重要研究的凝膠，是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn)，以選出zui適凝膠濃度。
表3不同分子量范圍的蛋白質(zhì)和核酸在凝膠電泳 中所選用的凝膠濃度百分率
物 質(zhì)
分子量范圍
適用的凝膠濃度（%）
蛋白質(zhì)
<10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×105
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
核酸
<104 104-105 105-2×106
10-20 5-10 2-3.6
聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨 能力。
蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇，SDS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白 質(zhì)—SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可引起構(gòu)象改 變，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物 的短軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，在凝膠中的遷移率，不 再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小，因而SDS聚可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。
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